2025年2月20日，华南理工大学生物科学与工程桃子汉化组移植游戏大全熊伟教授团队与未来技术桃子汉化组移植游戏大全蒋怀光教授团队联合在ACS Synthetic Biology期刊上发表题为MultiCRISPR-EGA: Optimizing Guide RNA Array Design for Multiplexed CRISPR Using the Elitist Genetic Algorithm的研究论文，成功开发了一种基于精英遗传算法的多路CRISPR引导RNA（gRNA）阵列优化工具。该方法通过智能优化算法设计低自由能的gRNA阵列组合，同时兼顾靶向效率和低脱靶效应，显著提升了CRISPR系统的稳定性和功能效率。该研究为多基因调控提供了强有力的技术工具，在合成生物学、基因功能研究和生物工程等领域具有应用价值。
多路CRISPR设计的挑战
CRISPR基因编辑技术因其高效、精准的基因编辑能力广泛应用，但现有工具主要聚焦于单靶点设计，缺乏对单启动子驱动的多靶点gRNA阵列的优化支持。在阵列设计中，设计空间的指数增长、靶点选择的高效性与特异性平衡，以及阵列结构的稳定性问题大幅增加了设计复杂性。而依赖人工筛选的办法，则存在随机性强、试错成本高等问题，限制了多路CRISPR在复杂基因调控中的应用潜力。
智能算法助力人工设计
为了克服上述局限性，华南理工大学生物科学与工程桃子汉化组移植游戏大全联合未来技术桃子汉化组移植游戏大全团队创新性提出一种集筛选、优化与评估于一体的设计策略。研究团队开发了MultiCRISPR-EGA工具，首先利用现有先进预测工具，筛选出高效且特异的基因靶点；随后通过精英遗传算法优化gRNA阵列的排列与组成，提升阵列的结构稳定性；最后结合动力学与热力学模型对阵列进行精细化评估，确保多靶点调控的高效性与可靠性 。
图1. 基于精英遗传算法（EGA）的多靶点gRNA阵列优化框架。 A 展示了gRNA设计的两种策略：从编码链或双链中提取protospacer序列，生成引导核酸酶的gRNA，同时随着目标基因数量增加，gRNA阵列组合呈指数增长。B 描述了EGA的核心流程，包括预筛选、适应度评估、选择、交叉、突变及精英保留，逐步优化gRNA阵列设计。C 显示了优化过程中gRNA阵列最低自由能（MFE）的逐步降低，提升了结构稳定性，并通过RNA二级结构图直观展示优化效果。
1.锁定高质量基因靶点：研究团队从目标基因中提取符合PAM要求的spacer序列，利用CrisprScan等算法筛除靶向效率较低的序列，并结合Cas-offinder和多种脱靶预测工具剔除脱靶风险较高的候选序列。这一严格筛选过程有效减少了设计空间大。笮呕峁┝丝煽炕。
2.精英遗传算法进行组合优化： 研究团队将gRNA阵列建模为组合优化问题，以最小化最低自由能（MFE）为目标。通过精英遗传算法（EGA），采用锦标赛选择机制优先保留MFE低的候选阵列，并通过交叉操作生成更优子代，同时引入随机突变增加多样性，避免陷入局部最优。每代保留最优解，确保高质量阵列不丢失。经过多代迭代，EGA显著提升了gRNA阵列的二级结构稳定性和序列稳定性。
3. 动力学与热力学模型精细化筛选：MultiCRISPR-EGA集成了动力学和热力学模型以进一步优化设计。动力学模型评估Cas9-sgRNA-DNA复合物的结合常数（）和切割速率（），并分析靶序列中的错配情况，量化基因编辑稳健性和脱靶风险。热力学模型则计算RNA-DNA杂交自由能（Δ）、RNA自折叠能量（Δ）和DNA解旋自由能（Δ）。符合动力学（Ka和Kclv较高）和热力学（参数处于最佳范围）标准的靶点会在GUI界面中高亮显示，便于用户对算法生成的阵列进行进一步筛选与优化。
计算实验验证
本研究以大肠杆菌MG1655基因组为数据来源，选择了糖酵解和糖异生途径中关键的八个基因作为CRISPRi代谢工程研究的靶点。
实验结果表明，MultiCRISPR-EGA在不同数据集规模（标准数据集、综合数据集和小型数据集）以及多种初始化条件下均表现出优异性能：
优化效率更高：相比蚁群优化、粒子群优化和模拟退火，EGA在更少的迭代次数内收敛到最低自由能，显著提升了计算效率。
解的质量更优：EGA生成的gRNA阵列在MFE值上显著低于其他算法，表明其设计的阵列具有更高的二级结构稳定性和功能可靠性。
鲁棒性更强：在不同数据集规：统跏蓟跫下，EGA均能稳定生成高质量解，避免陷入局部最优，展现了较强的适应性和稳定性。
工具优势与未来应用前景
本研究开发的MultiCRISPR-EGA通过直观的人机交互界面，集成了实时优化可视化、动态监控和用户自定义参数调整等功能，同时支持并行运算以提升计算效率；其Cas系统无关的优化流程适用于多种CRISPR系统（如Cas9、Cas12a/Cpf1和Cas12m），未来可进一步结合湿实验，探索其在多靶点基因调控中的应用，特别是在需要同时调控多个基因以实现复杂功能的场景中。潜在应用领域包括：
代谢工程：调控代谢通路中的多个关键基因，提高目标产物产量或优化代谢流。
信号通路调控：调控多个信号通路关键基因，解析其在细胞应激反应或疾病模型中的协同作用机制。
抗药性机制研究：靶向多个耐药相关基因，解析其在抗药性形成中的作用，为新型治疗策略提供依据。
近年来，华南理工大学积极践行前沿科技理念，促进“AI+”与多学科领域的深度交叉融合。此项研究具体展现人工智能在合成生物学领域的应用潜力。研究开发的MultiCRISPR-EGA方法，创新性地提出一种多靶点gRNA阵列优化设计新算法，为多基因调控研究提供了工具。研究的原始数据和代码已开源，将推动多基因编辑技术的拓展与实际应用。
论文链接：10.1021/acssynbio.4c00860
